Tilraunaforrit og bilanaleitarlausnir fyrir ofsíunar miðflótta rör

Ofsíunar miðflóttarör er algengt notað himnusíunartæki á rannsóknarstofunni. Kjarnahluti þess er ofsíunarhimna með ákveðinni mólþungamörk. Algeng ofursíunarhimnuefni eru pólýetersúlfón (PES) og endurmyndaður sellulósa (RC). Vinnureglan í miðflóttarörinu fyrir útsíunar er að nota miðflóttaafl og sameinda-stærð-sigtun til að keyra litlar sameindir í gegnum ofsíunarhimnuna, sem gerir þannig kleift að þétta, afsölta, skiptast á jafna eða hreinsa og aðskilja lífmakrósameindir eins og prótein og kjarnsýrur.

 

MWCO Val

Prótein	Mælt er með MWCO	Ráðlagður miðflóttatími
6–20 kDa	3 kDa	40 mín
20–30 kDa	5 kDa	30 mín
30–60 kDa	10 kDa	20 mín
60–100 kDa	30 kDa	20 mín
100–200 kDa	50 kDa	15 mín
200–600 kDa	100 kDa	15 mín
>600 kDa	300 kDa	15 mín
Einfaldar- eða tvöfaldar-kjarnsýrusameindir	Mælt er með MWCO	Ráðlagður miðflóttatími
137–1159 bp	30 kDa / 100 kDa	10 mín (fastur-hornsnúningur, 5000 × g)
Nanóperlur	Mælt er með MWCO	Ráðlagður miðflóttatími
1,5–2 nm	3 kDa	40 mín
2–3 nm	5 kDa	30 mín
3–5 nm	10 kDa	20 mín
5–7 nm	30 kDa	20 mín
7–10 nm	50 kDa	15 mín
10–30 nm	100 kDa	15 mín
>30 nm	300 kDa	15 mín

 

Fyrir prótein er mælt með því að velja himnu MWCO sem er 2-6 sinnum lægri en mólþyngd markpróteinsins. Ef flæðihraði er einnig íhugað er mælt með himnu MWCO undir þessu 2×–6× bili.

 

Umsóknarmál (DNA frá úthellt frumum)

Fyrir hefðbundna aðferð var 2,5 cm × 2 cm stykki af grisju skorið, lýsað í litlu -rúmmálskerfi og hreinsað beint með tækinu. Fyrir styrkingaraðferðina var grisjasýnatökusvæði tvöfaldað. Eftir leysingu var meltingarfljótandi vökvinn fluttur í 100 kDa ofursíunar miðflóttaglas, þétt með skilvindu við 10.000 r/mín, endurheimt með öfugum skilvindu og síðan sett í DNA útdrátt með því að nota fullkomlega sjálfvirkt kjarnsýruhreinsunartæki. Skolunarrúmmálið var jafnt stillt á 40 μL til að tryggja að upphafsfrumumagn í hópunum tveimur væri í meginatriðum sambærilegt.

 

Megindlegar prófanir sýndu að meðalstyrkur DNA var 0,099 ± 0,041 ng/μL fyrir hefðbundna aðferð og 0,193 ± 0,068 ng/μL fyrir styrktaraðferðina. Munurinn á hópunum tveimur var tölfræðilega marktækur (P < 0,01). Heildarafrakstur DNA sem fékkst með styrktaraðferðinni var 1,95 sinnum meiri en hefðbundin aðferð, sem sýnir að ofsíunarþéttniþrepið olli nánast engu tapi á heildar DNA. Ct gildi hópanna tveggja voru 27,64 ± 0,39 og 27,58 ± 0,40, í sömu röð, með P > 0,01, sem gefur til kynna að ofsíunarmeðferð hafi ekki komið inn á PCR mögnunarhemla eða truflað síðari mögnunarviðbrögð.

 

Fyrir STR arfgerð var heildar arfgerð skilgreind með heilum böndum á hverjum stað og meðaltopphæð Stærri en eða jöfn 200 RFU. Meðal 20 samhliða sýna gaf hefðbundna aðferðin fullkomnar arfgerðir fyrir aðeins 14 sýni, en styrktaraðferðin náði fullkominni STR arfgerð fyrir öll 20 sýnin, sem bætti verulega skilvirka arfgerðargreiningarhraða snefilsýna.

Guidling Technology ofursíunar miðflóttahólkar eru með einfalda aðgerð, háa styrkleikastuðla og hátt endurheimtarhlutfall sýna og eru mikið notaðar í lífefnafræði, sameindalíffræði og öðrum sviðum. Endurheimtuhlutfall Guidling Technology ofursíunar miðflóttaröra er mismunandi eftir því efni sem unnið er með og getur almennt farið yfir 90%.

 

Algeng bilanaleit

Vandamál	Möguleg orsök	Lausn
Úrkoma á sér stað við einbeitingu	Einbeitingin er of hröð	Dragðu úr skilvinduhraða
		Notaðu ofsíunarrör með hærri mólþungamörk
		Pípettaðu upp og niður í miðflóttaglasinu, skilvinduðu síðan aftur
	Yfir-einbeiting	Mælt er með því að endanlegur styrkur próteins eftir þéttni fari ekki yfir 20 mg/ml
Ekki er hægt að sía vatn í gegnum	Ofsíunarhimnan er alveg þurr og yfirborð himnunnar verður veikt vatnsfælin	Vættu himnuna með leysi með lágum-yfirborðs-spennu (td framkvæmdu frumskilvindu með 20% etanóli í vatni)
Ekkert markprótein er til staðar í þykkninu	Upphafsstyrkur próteinsýnis er of lágur (< 25 μg/mL)	Ef styrkur sýnisins er lítill og rúmmálið er stórt, hlaðið sýninu endurtekið og skilið
	Rangt val á himnu MWCO	MWCO himnunnar er almennt minna en 2 sinnum mólþungi markpróteins eða meira
	Miðflóttakraftur er utan tilgreinds sviðs	Ráðlagður miðflóttakraftur: 3000–5000 × g
	Markprótein hefur fallið út	Stilltu markpróteinstyrkinn í þykkninu (stilltu styrkleikastuðulinn)
		Stjórna hitastigi og pH
		Notaðu aukefni
		Stilltu jónastyrkinn
Truflanir eiga sér stað við niðurstreymisgreiningu á þéttu próteini	Ofsíunarhimnan inniheldur snefilmagn af glýseróli	For-þvoðu ofsíunarrörið með biðminni og hreinsuðu vatni. Ef truflun er viðvarandi skaltu þrífa með 0,1 M NaOH, skola síðan með hreinsuðu vatni og þurka
RNase mengun	Ekki er tryggt að ofsíunarrörið sé RNase-laust	Mælt er með því að liggja í bleyti í 0,1% DEPC við 37 gráður í 2 klukkustundir til að gera RNase algjörlega óvirka; leifar af DEPC má fjarlægja með því að skola með hreinsuðu vatni
Endotoxín mengun	Meðfylgjandi ofsíunarrör hafa ekki gengist undir meðferð til að fjarlægja endotoxín- og endotoxín eru víða til staðar í náttúrunni	Fyrir tilraunina skaltu forhreinsa með 0,5 M NaOH, fylgt eftir með því að skola með hreinsuðu vatni til að fjarlægja flest endotoxín